常見問題

常見問題

抗體常見問題

  • 工作液和濃縮液的區別?
    工作液主要針對病理醫生用,為了他們方便,不再自行稀釋。
    如果是科研用,抗體的稀釋比例還是需要研究者自行摸索,染色強度最高,而背景值又最低。也就是需要找到最高信噪比的最佳比例。
  • 抗體用什麽稀釋?
    抗體稀釋最好使用抗體稀釋液。因為抗體稀釋液可以有效保證抗體蛋白的穩定性。
    抗體也可以用PBS緩衝液配製,但是必須現用現配。
  • 抗體如何保存?
    抗體保存得當與否,直接決定了抗體的活性和使用效果!因此請務必按照說明書推薦的保存條件正確保存抗體!並且避免抗體反複凍融。
  • 抗體如何運輸?
    雖然好多抗體的保存溫度是-20度,但是目前抗體的運輸都為4度運輸。目的是為了避免反複凍融對抗體活性的損害(如果使用幹冰運輸,那麽收到時抗體是凍起來的,為了分裝就需要解凍。這就多了一次凍融的過程)。所以運輸過程中絕對避免幹冰運輸!

檢測係統常見問題

  • 為何非生物素法檢測係統不用血清封閉?
    血清封閉的作用是封閉掉組織中的帶電荷團,防止它們與抗體結合,產生非特異染色.這並不影響接下來一抗的結合,因為這種結合是特異的,親和力遠遠高於因電荷作用的結合,血清與非特異性位點結合,可以消除非特異性染色,提高目的蛋白的準確性和降低背景。非生物素法檢測係統的實驗結果證明封閉和非封閉結果差異不大。當然,如果您為了追求更好的實驗結果,也可以自行封閉。
  • 如何選擇合適的檢測係統?
    目前,推薦使用非生物素法檢測係統,因為可以避免內源性生物素的幹擾。您購買一抗的種屬來源和組織是兩個考慮要素。如果組織是人標本,一抗來源是小鼠,那麽可以選擇通用型或者以2結尾的檢測係統;一抗來源是兔,那麽選擇通用型或者以1結尾的。但是組織並不局限於人的標本,當然必須是能夠排除交叉性反應的動物組織。比如,一抗是小鼠來源,再用於小鼠組織,那麽小鼠組織內源性IgG就會幹擾實驗結果。

免疫組化常見問題

  • 無染色
    A. 真陰性。
    解決的方法非常簡單,就是設立“陽性對照”。如果陽性對照有了表達,說明染色的全過程和所有試劑都沒有問題。如果此時測試片仍為陰性,便是真實的陰性,說明組織或細胞沒有相應的抗原表達。反之,如果陽性對照沒有著色,表明染色過程中某個或某些步驟出了問題或試劑出了問題。
    B. 假陰性。
    (1) 是否加了試劑,包括一抗、二抗、三抗及底物等。
    (2)試劑是否按正確的順序加入以及孵育了足夠的時間。
    (3) 檢測係統是否和一抗匹配,這一點是非常重要的。
    (4)二抗檢測係統與顯色試劑不匹配。
    (5)抗體的稀釋比例是否過大及稀釋抗體的溶液是否正確。
    (6)標本中抗原含量過低也會出現陰性結果。可使用有放大效應的監測係統進行檢測。
    (7)所檢標本或切片的組織抗原是否丟失,如標本未及時固定或切片在室溫放置時間過長都會使抗原丟失。最好用已知陽性的標本來同時做陽性對照。
    (8)抗體是否過了有效期和抗體的保存條件是否正確。
    (9) 色原/底物溶液是否失效,最簡單的檢測方法是將一滴標記有酶的抗體滴加在一張白紙上,然後將製備好的底物溶液滴在上麵,如果發生預期的顏色變化,則可排除底物的因素。
    (10)水溶性色原顯色後使用了含醇的複染液或用乙醇脫水、二甲苯透明(如AEC、BCIP/NBT、AP-Red等顯色試劑)。解決的辦法是重新染色。
    (11)衝洗液是否和反應試劑匹配,溶液的pH值很重要,與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應含有疊氮鈉。
  • 弱陽性
    A. 標本的固定方式。不當的固定方式或固定時溫度過高,都會影響到所檢測的抗原的數量和質量。
    B. 抗原的修複方式。煮沸修複和高壓修複是國際公認的較好的修複方式,但具體使用那種修複方式應根據預實驗結果或廠家說明書進行選擇。
    C. 抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間是否正確。應參照使用範圍,對所使用的一抗進行梯度測試,找出最佳的使用濃度。
    D. 切片上遺留了過多的衝洗液,當抗體加至切片上時,等於人為地對抗體進行了進一步的稀釋。
    E. 孵育時切片是否放置水平,否則會導致抗體流失。
  • 非特異性染色
    A. 是否有效地去除了內源性酶和生物素。應注意的是,並不是每一種組織均需要進行此步驟,但對於內源性酶或生物素豐富的組織,如肝髒、腎髒等,需考慮此原因。
    B. 滅活堿性磷酸酶:當使用堿性磷酸酶顯色係統時應滅活內源性的堿性磷酸酶。
    C. 滅活內源性過氧化物酶:當使用DAB顯色係統時應滅活內源性過氧化物酶。
    D. 取材時避開出血、壞死區亦極重要。因為出血和壞死區內源性酶含量高,極易產生非特異染色。
    E. 所選擇的抗體是否符合實驗要求。因抗體不純、標本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇等原因造成的非特異性染色隻能通過采用高純度、高效價的抗體、或針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。
    F. 一抗的使用濃度是否過高。有些抗體濃度過高會使肌組織或纖維組織產生非特異著色。
    G. 清洗是否充分。清洗時既要清洗幹淨又不能使切片脫片,這是洗滌的原則。溶液內加入Tween-20,即可提高洗滌效果又可增加組織的通透性,使抗體與組織的結合更強。
    H. DBA的使用是否正確。DAB的孵育時間、保存和配製方式都可以產生某些背景顏色。
    I. 標本染色過程中是否曾經幹涸,否則會造成邊緣部的非特異性染色。
    J. 巨噬細胞吞噬各種抗原物質或Fc片斷而出現胞漿著色,這種著色不易避免,但可以通過形態學辨認出巨噬細胞而引起重視。
  • 全片著色
    A. 抗體濃度過高是常見的原因之一。解決辦法是找到適合自己實驗室的理想工作濃度。
    B. 抗體孵育時間過長或溫度較高。解決辦法是,嚴格執行操作規程。
    C. DAB變質和顯色時間太長:DAB最好現用現配,如有沉渣應進行過濾後再用。
    D. 組織變幹。解決的辦法是操作要認真仔細,采用免疫組化筆在組織周圍畫圈,可以有效的避免液體流失,也能提高操作速度。
    E. 切片在緩衝液或修複液中浸泡時間太長(大於24小時)。
    F. 一抗變質或質量差的多克隆抗體:注意抗體的有效期,過期的抗體要麽不顯色、要麽背景著色。最好設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。
  • 陰陽臉”著色 “陰陽臉”著色
    A. 組織脫蠟時脫蠟液未沒過組織,使部分組織脫蠟不足或未脫蠟。
    B. 抗原修複時修複液未沒過組織使組織幹燥,幹燥的組織則不顯色。
    C. 滴加的抗體(一抗或二抗)流到了組織的一側,這是切片不平的緣故。通常應該在加完試劑後,仔細檢查。
    D. 加抗體時未完全覆蓋組織:如有這種情況,建議用牙簽而不是用吸頭或試劑瓶口將試劑引流開使之將組織全部覆蓋。
    E. 用免疫組化筆在組織周圍畫圈時,劃線太靠近或畫到了組織上,由於筆油的力學原理,試劑不能達到靠近劃線附近的組織也會出現這部分組織不顯色。
    F. 加抗體時產生了氣泡,氣泡下麵的組織不顯色。由於氣泡中含氣,試劑被推到周圍,因此,氣泡中心的組織會產生圓形的不著色。解決辦法是滴加試劑時手法要輕,有氣泡時用牙簽捅破。
  • 灶片狀著色
    A. 裱片時水未排盡,或組織的局部形成氣泡使組織突起,染色時試劑滲入後不易洗盡,顯色過深。解決辦法是,漂片盒裏的氣泡應去盡,漂片時一旦產生了氣泡可將鑷子伸到水裏從組織下麵輕輕將氣泡移走。撈片後要傾斜放置幾分鍾利於水流走,然後在放到烤片儀上進行烤片。
    B. 壞死組織灶,組織壞死後細胞破壞、酶的釋放、蛋白遊離、分解,複雜的肽鏈殘段(如Fc段)可能與一抗或/和二抗結合導致最終著色。解決辦法是在選擇染色切片時應避免選擇壞死組織較多的組織。
    C. 製作膠片時,膠的濃度太高,膠在載玻片上不均勻,顯色時膠厚的地方容易非特異灶片狀著色。解決辦法是按照標準的製備方法進行。
  • 抗體易位表達
    A. 錯誤的抗原修複方式,是抗體表達易位的常見原因。
    B. 不適當的組織處理可以出現細胞核著色,如組織在二甲苯裏浸泡時間太長(如從星期五浸泡到下星期一)、緩衝液中浸泡時間太長、組織變幹等,解決辦法是嚴格按照操作標準進行工作。

FISH常見問題

  • 消化不足
    表現:
    細胞成塊,沒有清楚的邊界;
    信號弱,可見細胞間連接物。
    解決:
    檢查酶溶液的溫度並增加消化時間;
    檢查預處理液的溫度並增加預處理的時間。
  • 過消化
    表現:
    沒有清楚的細胞邊界,細胞形態被破壞;
    可能有弱的或缺失的信號;
    熒光背景高。
    解決:
    檢查酶溶液的溫度並減少消化時間;
    檢查預處理液的溫度並減少預處理的時間。
  • 過預處理
    表現:
    沒有清楚的細胞邊界,具不規則的細胞形態;
    可能有弱的或缺失的信號。
    解決:
    檢查酶溶液的溫度並減少消化時間;
    檢查預處理液的溫度並減少預處理的時間。
  • 雜交時間不當
    表現:
    形態正常、信號弱;
    解決:
    增加雜交時間;
    檢查探針量;
    檢查雜交後洗脫條件。
  • 背景高
    原因:
    雜交後洗脫不充分。
    解決:
    檢查洗脫液的溫度。
  • 信號強度變化
    原因:
    由於氣泡造成的探針不均勻分布。
    解決:
    重複實驗並確認雜交期間蓋玻片下無氣泡;
    在探針混合物的第一接觸麵加蓋蓋玻片。
  • 組織掉片或組織形態分解
    原因:
    組織固定不足;
    使用不恰當的玻片;
    不正確的烤片;
    移除蓋玻片時組織被撕掉;
    過消化;
    過預處理。
    解決:
    校驗固定條件;
    使用正確的玻片;
    校驗烤片條件;
    泡更長的時間使蓋玻片脫落。
  • 過變性
    表現:
    線狀信號。
    解決:
    檢查變性的時間和溫度。
  • 無/弱信號
    可能的原因 推薦的解決方案
    未添加探針(別笑,特別是探針和雜交緩衝液分開的非預混情況) 探針充分解凍,確保移液器吸取到探針試劑。
    探針、雜交緩衝液使用前沒有充分混勻(非預混探針) 吹打探針混合液,使探針充分混勻,短暫離心。
    探針添加數量不足 確保移液器吸取準確,探針加入量足量,請不要稀釋探針(包括預混和非預混)。 使用前確保探針解凍充分並達到室溫。
    變性前標本未製備好 請參照說明書中標本製備相關說明。
    標本及探針變性不充分 確保玻片進行變性時溫度在推薦的溫度。 將玻片變性時間延長2~4分鍾。
    變性前標本未製備好 請參照說明書中標本製備相關說明。
    標本及探針變性不充分 確保玻片進行變性時溫度在推薦的溫度。 將玻片變性時間延長2~4分鍾。
    雜交條件不合適 確保遵守雜交所規定的時間和溫度。 橡皮膠封片時勿留縫隙。 根據情況,調整雜交時間(跨度一般較大)和濕度。
    雜交時蓋玻片下有氣泡形成 放蓋玻片時要覆蓋探針表麵,輕輕擠壓以便擠出氣泡。
    玻片幹燥不充分 探針滴加至玻片前,確保玻片上的乙醇溶液已經完全揮發。
    探針幹燥太快 探針滴加後應立即將蓋玻片覆蓋目標區域。 進行洗脫時,一次隻能移除一張玻片上的蓋玻片,並且在移除下一張之前立即將玻片浸入洗脫液中。
    洗脫液或洗脫條件不正確 確保按照產品說明書要求配製洗脫液(生產商提供洗脫液的除外)。 確保洗脫液的溫度達到洗脫步驟所規定溫度。 玻片浸入洗脫液前移去蓋玻片。
    探針或標本玻片儲存不正確 確保探針-20℃避光保存。 將未雜交玻片幹燥後置於-20℃長期保存或者室溫短期保存(一般不超過兩星期)。 將雜交後玻片置於-20℃避光保存。
    觀察時所選用的濾光片不合適 使用正確濾光片觀察探針熒光情況。詳情谘詢探針供應商。
    顯微鏡構造及物鏡不適宜觀察FISH標本,或者濾片組損傷 請聯係顯微鏡製造商。
    汞燈使用時間超過設計時間 請更換汞燈。