FISH

FISH

一、FISH探針是個啥?

熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization),簡稱FISH。 是采用熒光標記的DNA探針,利用探針與被檢測樣本DNA堿基對的互補性,在探針與樣本的DNA雜交後,通過熒光顯微鏡檢測熒光信號而得出結果,從而檢測細胞,組織樣本中的染色體或基因異常。

首先,我們知道需要檢測的對象是DNA,而檢測目標DNA所用的工具是用熒光染料做了標記的DNA,能夠被觀察到,這個就是FISH探針了。

熒光信號最終需要被肉眼觀察到,而肉眼的分辨率是有限的,所以FISH探針的大小一般都比較長一點,多數有幾百個kb。由於本身這個特點,FISH探針適用於檢測染色體的斷裂融合或者大片段的擴增、缺失或者染色體數目的變化,而不適用於突變檢測。

以最常見的HER2產品為例,設計原理如下:

HER2基因位於17q11.2-q12,設計者把HER2探針標記為紅色,使其能夠覆蓋HER2基因,同時,由於著絲粒相對保守,把相應位點標記為綠色作為對照。

設計者選擇位點的差異以及工藝技術的差異則造成了不同探針敏感性和特異性的差異。

二、工欲善其事,必先利其器

目前市場上在售的FISH探針,顏色各不相同,那是因為標記的熒光素各不相同,主要的有以下幾種:

熒光素 顏色 激發波長 發射波長
FITC 綠色 492 520
Cy3 橙色 550 570
TRITC 橙紅色 550 620
Texas Red 紅色 596 620
SpectrumOrange 橙色 559 588
SpectrumGreen 綠色 497 524
SpectrumAqua 青藍色 433 480
DAPI 藍色 367 452

熒光想被看到,需要被特殊光源激發後通過合適的濾光片才行,所以,探針生產商會在說明書上標明自己生產探針所使用的熒光素種類,然後建議“顧客使用探針前向濾片組供應商了解所使用的濾片組的詳細情況,以便選擇與標記熒光染料相適應的濾片組”。選擇合適的濾光片是非常重要的,畢竟我們通過觀察FITC的濾光片怎麽也看不見Cy3不是?

以常見的奧林巴斯BX53顯微鏡為例(其他品牌也差不多),它的濾光單元長這樣:

上圖中手裏拿著的小結構就是已經裝了盒的濾光片。用來觀察FISH實驗結果的熒光顯微鏡,通常至少安裝有3組濾光片,分別用來觀察橙色、綠色以及藍色的熒光。濾光片可以單獨安裝,所以,實驗室如果已安裝了熒光顯微鏡,那麽在開展了新項目包含了新的熒光素種類時,拓展一個相應的濾色片就可以。

熒光顯微鏡中,除了濾色片,激發光源也需要注意,目前大多數熒光顯微鏡使用的是汞燈作為光源,而汞燈是有使用壽命的。所以,用了一段時間後,激發出的光變的弱了,老師,您的顯微鏡不是壞了,隻是汞燈老了,換個嫩的就行。

FISH實驗中,主要的儀器除了熒光顯微鏡,還有原位雜交儀:

原位雜交儀承擔了探針和樣本變性以及雜交的重任,可以提供精確且均一的溫度。

原位雜交儀不僅可以用來進行熒光原位雜交的實驗,也可以做原理類似的其他標記物(例如地高辛)標記的原位雜交實驗。

三、標準化是有必要的

FISH操作的步驟好像每一家都不是很一樣,它們之間的差異體現在哪兒?

其實,不論具體的步驟,FISH實驗過程都可以被分成幾個大的部分:

根據樣本類型的不同,前期處理的方法也不同。目的在於保持組織細胞形態的完整,讓細胞或者組織以最好的狀態呈現在載玻片上。以最常見的石蠟樣本為例,推薦的處理方法如下(這個大家區別不大):

常溫下在10%中性福爾馬林緩衝液中固定24小時,為了達到最佳和均勻的固定和石蠟包埋,樣本大小不宜超過0.5cm3。標準操作和石蠟包埋,使用高質量的石蠟。滲透和包埋應在低於65℃下進行。切成4μm厚度的切片。切片撈於防脫玻片並在50~60℃環境中固定2~16小時。

預處理包括脫蠟、預處理、酶消化,目的在於把細胞核裸露出來、增加膜的通透性,讓探針可以更好的進入細胞核與染色體DNA結合。由於各家探針生產商生產的探針敏感性和特異性有差異,對樣本處理完的狀態要求也不盡相同(比如:探針敏感性足夠好,預處理的不是很好,探針也可以穿過核膜與染色體結合),所以預處理的條件會有一定的差異,各生產商所建議的預處理條件都是經過多次試驗證明與其探針相適應的,因此建議實驗過程中按照生產商提供的說明書進行操作。

同理,探針的變性和雜交的過程就是探針與目標DNA的結合過程,想要結合的好,就需要理想的化學和溫度條件,而這個條件也是經過梯度實驗最終確定的。

而雜交後洗脫的條件與變性雜交的條件有一定的關係,洗脫的溫度與時間都與探針最終的結合情況相關,通俗來講,如果結合的好,那麽洗的厲害點也沒關係,如果結合的不好,就得悠著點洗了。DAPI是一種能夠與DNA強力結合的熒光染料,因為DAPI可以透過完整的細胞膜,所以在FISH實驗中用於細胞核的複染。

綜上,由於各家探針敏感性和特異性的不同導致的所有操作條件上的差異,都是係統性的,因此在實驗過程中,並不建議不同生產商的探針和輔助試劑混用,按照說明書上的標準操作進行,有助於得到理想的實驗結果。當然,如果您的實驗室已經通過實驗確定了自己的標準操作條件,就大膽的上吧。